高效液相色谱法测定蜂王浆中羟甲基糠醛含量

本实验在参考前人研究的基础上，对提取方法、线性范围、方法适用性等方面进行研究，结合实际样品的测定，建立一种稳定、灵敏度高、适应性好的蜂王浆中羟甲基糠醛含量的测定方法。
1 材料与方法
※分析检测食品科学2008, Vol. 29, No. 03 413
1.1 仪器与试剂
P 6 8 0 高效液相色谱仪 D i n o e x 公司；固相萃小柱ENVI-C18(500mg，6ml)；固相萃取装置 Supelco 公司；Turbo Vap LV 氮气吹干仪；离心机 Sigma 公司。羟甲基糠醛标准品(97.0%) Sigma公司；磷酸(优级纯) ；甲醇(色谱纯) ；乙酸锌溶液(150g/L)；亚铁氰化钾溶液(300g/L)；10% 的甲醇水溶液(10ml 甲醇与90ml水混合)；实验用水为超纯水。
标准溶液的配制：准确称取标准品，用去离子水
配制成0.5mg/ml 的储备液。分析前用流动相配制成一系列不同浓度的标准工作溶液。
1.2 样品处理
称取5g 试样，精确到0.001g，置于50ml 容量瓶中，加入30ml 水振荡溶解。待样品溶解后，分别加入3ml 乙酸锌溶液和3 m l 亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白，用水定容至刻度，混匀，静置1 0 m i n 。将溶液转移到离心管中，在5 0 0 0 r / m i n 离心1 0 min，取上清液，待净化。将E N V I - C 1 8 萃取柱固定在萃取装置上，分别加入5ml 甲醇、10ml 纯水活化平衡，保持柱的湿润。取15ml滤液到固相萃取柱中，上清液以不大于3ml/min 流速通过固相萃取柱，待液体完全流完后，用5 m l 1 0 % 甲醇水溶液清洗固相萃取小柱；真空减压抽干后，用5 m l 甲
醇洗脱于1 0 m l 刻度试管中。将洗脱液用氮吹仪吹干后，用0.5ml 流动相溶解，样液经过0.45μm 的滤膜过滤后，上液相色谱仪测定。
1.3 液相色谱条件
色谱柱: Waters Symmetry-C18(4.6mm × 250mm，5μm ，W a t e r s 公司)；流动相：0 . 4 % 磷酸水溶液+ 甲醇(90+10)；流速0.8ml/min；检测波长285nm；柱温30℃；进样量2 0μl。
2 结果与分析
2.1 提取方法的优化
2.1.1 沉淀剂的选择
常用的沉淀蜂王浆蛋白的试剂有无水乙醇溶液，磷酸溶液，盐酸溶液，偏磷酸溶液，乙酸锌和亚铁氰化钾溶液等，经过实验，这些溶液均能很好的将蜂王浆中的蛋白沉淀。但由于羟甲基糠醛对强酸，热和氧化剂敏感，当用磷酸、盐酸、偏磷酸溶液时，羟甲基
糠醛的回收率很低，有可能在提取过程中，发生了分解。8 0 % 的乙醇水溶液对蜂王浆中羟甲基糠醛提取有很高的回收率，但在进一步净化前，需要用蒸发仪蒸干，而由于乙醇和水的混合液沸点很高，需要长时间的挥发，这不仅延长了测试样品的时间，而且在挥发的过程中羟甲基糠醛很容易降解，因此本实验选择乙酸锌和亚铁氰化钾溶液作为沉淀剂。通过优化实验确认，乙酸锌溶液的浓度为150g/L；亚铁氰化钾溶液浓度为300g/L，各使用3 m l 就可以有效的将蜂王浆中蛋白沉淀，并获得很好的提取回收率。
2.1.2 固相萃取小柱的选择
对比了BAKERBOND SPETM C18(500mg/6ml)；ODS(C18)PHASE(500mg/6ml)；ACCUBOND ODS(C18)(500mg/6ml)；Oasis HLB(500mg/6ml)小柱和ENVI-C18(500mg/6ml)五种反相固相萃取柱对蜂王浆样品的净化效果。实验表明，五种固相萃取柱差异较大，EN V I - C 1 8 小柱的回收率最高(90% 以上)，Oasis HLB 和BAKERBOND SPETM C18的回收率在7 5 %～8 5 %，O D S ( C 1 8) P H A S E 和A C C U B O N DO D S ( C 1 8 )柱的回收率在6 0 %～8 0 %。因此，本方法选择E N V I - C 1 8 固相萃取柱为净化柱。
2.2 液相色谱柱的选择
分别选用Symmetry C18 (4.6mm × 250mm，5μm)，Diamonsil C18 (4.6mm × 250mm，5μm)，Waters Nova-Pak C18 (3.9mm × 150mm，5μm)，μBondapak C18 (4.0mm× 3 0 0 m m，1 0μm )四种色谱柱对蜂王浆中羟甲基糠醛进行了色谱条件的实验。实验发现，这四种色谱柱都可以用于对羟甲基糠醛含量的分析，只有保留时间和灵敏度有所不同，Symmetry C18 柱灵敏度和峰型均很好，所以我们选用Symmetry C18 (4.6mm × 250mm，5μm)色谱柱进行羟甲基糠醛的测定。标准图谱与实际样品分离图谱
见图1 。
2.3 线性关系和检出限
用羟甲基糠醛标准储备溶液分别配制浓度为0 . 1 0、0.20、1.0、2.0、5.0、20.0mg/L 标准溶液，在选定的色谱条件下进行测定，进样量2 0μl ，用峰高与标准浓度作图，线性方程为Y=2.3772X+0.024，线性相关系数R2=0.9993。当检测0.10mg/L 标准浓度时，所测谱图的信噪比大于1 0 。根据最终样液所代表的试样量、定容体积和进样量计算，确定本方法检出限为0 . 2 m g / k g。
2.4 回收率和精密度
在样品上做0.2、1、5、10mg/kg 四个添加水平的加标回收率实验，每个浓度重复四次，测定的平均回收率及精密度见表1。在0.2～10mg/kg 添加浓度范围内，回收率在87.2%～93.1% 之间，相对标准偏差小于3.4%，能够满足蜂王浆中羟甲基糠醛含量的常规分析。
2.5 实际样品的测定
添加浓度 (mg/kg) 0.2 1 5 10
回收率Intra-daya 89.4±3.4 89.2±2.1 92.2±2.3 93.1±1.1
(%, X ± SD) Inter-dayb 87.2±3.1 91.7±3.2 91.2±2.7 92.3±2.5
表 1 蜂王浆中羟甲基糠醛的添加回收率
Table 1 Recoveries of hydroxymethylfurfural in royal jelly
注：Intra-daya 为日内添加回收率，测定4次；Inter-dayb 为日间添加回
收率，测定4 次。
414 2008, Vol. 29, No. 03 食品科学※分析检测
随机从市场上购买的蜂王浆样品1 4 个，采用本实验建立的高效液相色谱方法对样品进行分析，实际测定
结果见表2 。
结果表明，大多数样品中都检出了羟甲基糠醛，检出样品中羟甲基糠醛的含量在0.9～26.4mg/kg 之间。
羟甲基糠醛有可能能成为评价蜂王浆质量和贮存效果的指标之一。
3 结 论
蜂王浆样品基质复杂，富含蛋白质、脂类等物质。本实验采用亚铁氰化钾和乙酸锌沉降蛋白，结合固相萃取方法，有效地降低了基质干扰。方法回收率在87.2%～93.1% 之间，相对标准偏差为0.9%～3.4%，该方法具有方便、准确、灵敏度高、精密度好等优点，是一种测定蜂王浆中羟甲基糠醛的有效方法。